細胞凍存液作為凍存細胞時的液體環境,給細胞提供著營養和保護作用,可使冰點降低,提高細胞膜對水的通透性,能使細胞內水分在凍結前透出細胞,防止或減少冰晶對細胞的損傷,使細胞暫時脫離生長狀態而將其細胞特性保存起來,在需要時直接復蘇就可恢復細胞活性。傳統的細胞凍存液是使用培養基、血清和DMSO按照一定的比例混合,因其中的血清成分復雜、批次差異大等缺點,其應用具有局限性,且需要采用程序性降溫的凍存方法,費時費力。
無血清非程序細胞凍存液(無酚紅)化學成分明確,含有糖類、氨基酸等營養物質以及DMSO等多種保護劑,大大降低了在凍存過程中冰晶對于細胞的損傷,有效提高細胞復蘇率和活力;不含血清成分,減少了外源因子和污染源,更加安全、穩定;同時省去繁瑣費時的程序性降溫過程,可直接重懸細胞后置于-80℃保存,次日轉移到液氮中。
無血清非程序細胞凍存液 (無酚紅) 高效、安全、穩定、操作便捷,與傳統細胞凍存液相比具有明顯優勢(表1),推薦用于常規哺乳動物細胞(包括腫瘤或轉化細胞系、原代細胞、干細胞、免疫細胞等)的凍存,尤其適合無血清培養的細胞凍存。因本產品不含酚紅,所以也適用于激素相關實驗細胞的凍存。按照一般情況凍存1管細胞使用1mL凍存液計算,本產品可以用于大約100管細胞的凍存。
?表1：傳統細胞凍存液和耐思無血清非程序細胞凍存液(無酚紅)的特點比較
?使用方法
??(一) 細胞凍存：
【凍存前,請確保細胞處于對數生長期】
1.貼壁細胞制備細胞懸液：(懸浮細胞請忽略此步驟)
(1) 將舊培養基吸除,用PBS清洗兩遍。
(2) 在培養瓶中加入少許胰酶,以能覆滿瓶底為限。將培養瓶平置于培養箱中消化約1~2分鐘,期間在顯微鏡下觀察,一旦發現細胞間隙增大、細胞變圓、比較松動后,立即終止消化(個別難消化細胞需要延長消化時間,但要避免消化過度)。
(3) 加入適量溫浴好的完全培養基終止消化,輕輕吹打均勻細胞。
2.貼壁細胞和懸浮細胞的凍存：
(1) 取少量細胞懸液細胞計數,算出細胞總數和所需細胞凍存液的量。細胞的凍存密度以1×10^6~2×10^7 cells/ mL為宜。
(2) 將所需量的細胞懸液轉移至適當離心管中,200~500×g,離心3-5分鐘, 棄上清收集細胞。(離心速度和時間取決于細胞類型)
(3) 向細胞沉淀中加入適量無血清非程序細胞凍存液,用移液器輕輕吹打以重懸細胞,分裝于無菌細胞凍存管中,嚴密封口后,注明細胞名稱、代數、日期。
(4) 直接置于-80℃冰箱中儲存,細胞可至少保存一年;或者-80℃過夜后,次日將細胞投入液氮中長期儲存。
?
(二) 細胞復蘇：
1. 自液氮罐或-80℃冰箱中取出凍存管,檢查蓋子是否旋緊,立即放入37℃水浴中快速解凍。(避免冰晶重新結晶而造成細胞死亡),輕搖凍存管使其在1~2分鐘內全部融化,以75%酒精擦拭凍存管外部,移入無菌操作臺內。
2. 將解凍的細胞懸液移至15mL無菌離心管中,再加入5~10mL預熱好的完全培養基,輕輕混合均勻,200~500×g,離心3-5分鐘,棄上清收集細胞。(離心速度和時間取決于細胞類型)
3. 加入預熱好的完全培養基,混合均勻,轉移到細胞培養皿或培養瓶中,置于細胞培養箱中培養。
?注意事項
1. 凍存過程中,在將凍存液加入到細胞之后,請盡量在冰袋附近操作,因為低溫可以避免保護劑對細胞造成損傷。
2. 請保證細胞凍存管完全密封,避免在復蘇過程中凍存管炸裂。
3. 理論上,本產品適用于各種哺乳動物細胞的凍存,但因細胞系種類繁多,無法逐一驗證,因此我們推薦您在第一次使用本產品之前,事先對所凍存的細胞進行至少為期1周的試驗性細胞 凍存復蘇培養,確認性能后再進行正式凍存。
4. 本產品為無菌包裝,無需過濾,請注意無菌取用。
5. 為了您的安全和健康, 操作時請穿著實驗服并佩戴一次性手套。
